Was ist die Methode zum Nachweis der Aktivität alkalischer Proteaseaktivitäten?
Was ist die Methode zum Nachweis der Aktivität alkalischer Proteaseaktivitäten?
Enzymaktivität bezieht sich auf die Fähigkeit eines Enzyms, bestimmte chemische Reaktionen zu katalysieren. Die Größe der Enzymaktivität kann durch die Geschwindigkeit einer bestimmten chemischen Reaktion ausgedrückt werden, die sie unter entsprechenden Bedingungen katalysiert. Das Messen der Aktivität des alkalischen Proteaseenzyms Liaoning misst tatsächlich die Geschwindigkeit der durch das Enzym katalysierten chemischen Reaktion. Die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion kann durch die Abnahme des Reaktionssubstrats oder die Zunahme des Produkts pro Zeiteinheit ausgedrückt werden. Aus Gründen der Empfindlichkeit wird üblicherweise die pro Zeiteinheit produzierte Produktmenge gemessen. Da die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion ihren Anstiegswert im Laufe der Zeit allmählich verringern kann, muss die Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion bestimmt werden, um die Enzymaktivität korrekt zu messen.
Prinzip der Bestimmung der Aktivität alkalischer Proteaseaktivitäten Prinzip der Folinmethode
Alkalische Protease kann die Hydrolyse von Casein zu Tyrosin unter alkalischen Bedingungen katalysieren. Tyrosin ist eine Aminosäure, die eine phenolische Hydroxylgruppe enthält und mit Folin (einer Mischung aus Phosphorwolframsäure und Phosphomolybdänsäure) reagieren kann. (Folin-Phenol-Reaktion: Das Folin-Reagenz ist unter alkalischen Bedingungen äußerst instabil und kann durch Phenolverbindungen leicht quantitativ reduziert werden, um eine Mischung aus Wolframblau und Molybdänblau zu erhalten, die einen anderen Blauton aufweist.) Mit Hilfe der Kolorimetrie Das heißt Die Menge an produziertem Tyrosin kann bestimmt werden, und die Menge an Tyrosin, die durch Hydrolyse von Casein durch Liaoning-alkalische Protease in einer Zeiteinheit erzeugt wird, wird verwendet, um die Enzymaktivität auszudrücken, wodurch die Enzymaktivität berechnet wird.
Experimentelles Verfahren zur Bestimmung der alkalischen Proteaseaktivität
Vorbereitung der Enzymlösung: 1 g (± 0,001) trockenes Enzympulver genau wiegen, 10 ml Pufferlösung (2.2.5) zugeben, in einem kleinen Becherglas auflösen und mit einem Glasstab umrühren. Nach einer Weile Stehenlassen der Lösung der oberen Schicht vorsichtig in einen Messkolben gießen. In der Mitte eine kleine Menge Pufferlösung zum Sedimentteil geben, auf diese Weise viermal umrühren und auflösen und schließlich alles in einen 100-ml-Messkolben überführen . Mit Pufferlösung bis zur Marke auffüllen, gut schütteln und mit vier Schichten Gaze filtrieren. 5 ml des Filtrats entnehmen, in einen 100-ml-Messkolben überführen, mit destilliertem Wasser bis zur Marke verdünnen und die Enzymflüssigkeit mit einem 2000-fachen Gehalt verdünnen.
Definition der Aktivität der alkalischen Protease
Definition der Aktivitätseinheit für alkalische Protease: 1 Gramm alkalisches Proteasepulver kann unter den Bedingungen von pH 10 und 40 ° C 1 Mikrogramm Tyrosin pro Minute produzieren, was als Enzymaktivitätseinheit angesehen wird.
Vorsichtsmaßnahmen zur Bestimmung der Aktivität der alkalischen Protease
1. Die Temperatur, der pH-Wert und die Zeit der Enzymreaktion haben einen direkten Einfluss auf die Anzahl der hydrolysierten Peptidbindungen, daher muss sie streng kontrolliert werden.
2. Nach Beendigung der Reaktion mit Trichloressigsäure muss das durch Filtrieren des Reaktionsgemisches erhaltene Filtrat klar sein.
3. Da das Folin-Reagenz empfindlich gegenüber saurer Umgebung ist und sich leicht ändert, gibt es während der Messung eine Vorgabe in der Reihenfolge. Es ist notwendig, Natriumcarbonatlösung hinzuzufügen, um eine alkalische Umgebung zu bilden, und dann Folin-Reagenz hinzuzufügen, damit es normal funktioniert.
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