Prüfung auf Bacillus subtilis in mikrobiellen Futtermittelzubereitungen

ICS65.120                                                                                                                  CKlassifikationsnummer: B 46

GB/T 26428-2010

PNationale Standards der Volksrepublik China

Teststandard für Bacillus subtilis in Futtermitteln

Ausgestellt am: 2011-01-14                                                                                  

Implementiert: 01.07.2011 

Ausgestellt von:PAllgemeine Verwaltung der Qualitätsüberwachung, Inspektion und Quarantäne der Volksrepublik China und des Nationalen Verwaltungsausschusses für Standardisierung in China

Vorwort

Diese Norm wurde gemäß den Vorschriften von GB/T 1.1-2009 erstellt.

Dieser Standard unterliegt der Rechtsprechung des National Feed Industry Standardization Technical Committee (SAC/TC 76).

Dieser Standard wurde vorgeschlagen und entworfen von: The Microbiological Analysis and Testing Center of Guangdong Province.

Die wichtigsten Verfasser dieser Norm sind: Honghui Zhu, Xiaotang Sun, Songzhen Yang, Yuanliang Chen und Xianjiao Zhang.

Prüfung auf Bacillus subtilis in mikrobiellen Futtermittelzubereitungen

1. Geltungsbereich

Diese Norm legt die Vorschriften für die Untersuchung von Bacillus subtilis in mikrobiellen Futtermittelzubereitungen fest.

Diese Norm gilt für die Prüfung und Berechnung von Bacillus subtilis in mikrobiellen Futtermittelzubereitungen.

2. Normative Verweisungen

Die folgenden Dokumente sind für die Anwendung dieses Dokuments unerlässlich. Bei datierten Verweisungen gilt für dieses Dokument nur die datierte Version. Für zitierte Dokumente ohne Datum gilt für dieses Dokument die neueste Version (einschließlich aller Änderungen):

GB/T 8170 Numerische Rundungsregeln und Ausdruck und Beurteilung von Grenzwerten

GB/T 14699.1 Futtermittelprobenahme (GB/T 14699.1 – 2005, ISO 6497: 2002, IDT)

GB/T 20195 Tierfutter: Probenvorbereitung (GB/T 20195 – 2006, ISO 6498: 1998, IDT)

3. Verdünnungsmittel, Medien und Reagenzien

Sofern nicht anders angegeben, dürfen nur analysenreine Reagenzien und destilliertes oder entionisiertes oder gleichwertig reines Wasser für die Analyse verwendet werden.

3.1.  0,85 % sterilisierte Kochsalzlösung

3.2.  Nutritional Agar (NA)-Medium, siehe A.1 in Anhang A

3.3.  Gram-Färbelösung, siehe A.2 von Anhang A

3.4.  7 % Natriumchlorid-Wachstumsmedium, siehe A.3 von Anhang A

3.5.  VP Testen von Medien und Reagenzien, siehe A.4 von Anhang A

3.6.  Nitratreduktionsmittel und Reagenzien, siehe Anhang A.5

3.7.  D-Mannitol-Fermentationsmedium, siehe A.6 von Anhang A

3.8.  Propionat-Nutzungsmedium, siehe Anhang A.7

4. Ausrüstung und Glaswaren

Zusätzlich zu Laborgeräten, die üblicherweise in der Mikrobiologie verwendet werden, sind andere Geräte und Glaswaren wie folgt aufgeführt:

4.1.  Thermostatischer Inkubator: 37 ºC ± 1 ºC

4.2.  pH-Meter, auf ± 0,1 Einheiten genau

4.3.  Petrischale aus Glas oder Kunststoff

4.4.  Skalierte Pipette mit Markierungskapazitäten von 1 ml und 10 ml, mit einer Mindestskala von 0,1 ml bzw. 0,5 ml

4.5.  Glas- oder kunststoffummantelter Stab

4.6.  Mikroskop mit 1000-fachem Zoom

5. Probenahme

Die Testmuster sind echt und repräsentativ. Probenahmewerkzeuge wie Schaufeln, Löffel, Probennehmer, Reagenzgläser, Gläser, Scheren usw. sollten sterilisiert werden.

Die Proben sollten so schnell wie möglich in den mikrobiologischen Untersuchungsraum geschickt werden. Die Größe und Methode der Probenahme sollte gemäß GB/T 14699.1 implementiert werden.

6. Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung sollte gemäß GB/T 20195 durchgeführt werden, und die Probe sollte so schnell wie möglich nach der Vorbereitung inspiziert werden.

7. Betriebsverfahren

7.1. Probenvorbereitung für die Inspektion & anfängliche Suspendierung und zehnfache Verdünnung.

Wiegen Sie unter aseptischen Verfahren und Bedingungen 25 g (ml) der Probe, fügen Sie 225 ml 0,85 % sterilisierte physiologische Kochsalzlösung hinzu, homogenisieren Sie für 1–2 min und stellen Sie eine Anfangssuspension von 1:10 her. Ziehen Sie dann 1 ml der Anfangssuspension von 1:10, fügen Sie 9 ml 0,85 % sterilisierte physiologische Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie gründlich, um eine Verdünnung von 1:100 herzustellen. Nehmen Sie je nach Bakteriengehalt der Probe eine zehnfach zunehmende Verdünnung vor.

7.2.  Impfung und Kultur

2-3 geeignete Verdünnungen auswählen, 10 min im Wasserbad bei 80 ºC ± 1 ºC aufbewahren, 0,1 ml mit einer sterilen Pipette entnehmen und zwei Nähragarplatten (3.2) inokulieren. Verwenden Sie den Beschichtungsstab, um das Inokulum so vorsichtig und schnell wie möglich auf die Agaroberfläche aufzutragen. Der Beschichtungsstab darf den Rand der Petrischale nicht berühren. Verwenden Sie für jede Schale einen sterilen Beschichtungsstab. Die beschichtete Petrischale abdecken und 15 min bei Raumtemperatur stehen lassen, damit das Inokulum vollständig vom Agar aufgenommen wird. Die Platte umdrehen und für 48 ± 2 h in einen Inkubator bei 37 ºC ± 1 ºC stellen.

7.3. Koloniezählung und Screening

Wählen Sie nach der Inkubation eine Platte mit einer Koloniezahl zwischen 30-300. Wenn in der Schale große flockenförmige Kolonien wachsen, ist sie nicht zur Verwendung deklariert. Wenn die flockenförmigen Kolonien jedoch weniger als die Hälfte der Schale ausmachen und die Verteilung der Kolonien in der verbleibenden Hälfte sehr gleichmäßig ist, können Sie die Hälfte der Koloniezahl in der Schale berechnen und das Ergebnis mit 2 multiplizieren, um dies darzustellen Gesamtkoloniezahl der Schale. Die Kolonie des typischen Bacillus subtilis ist rauh, undurchsichtig, nicht glänzend, mit erweiterten Rändern, rund oder wellig, unregelmäßig geformt und grauweiß oder gelblich im Aussehen. Wählen Sie schließlich 5 Kolonien aus, die diese Eigenschaften zur Bestätigung des Experiments aufweisen.

7.4. Bestätigungstest

7.4.1. Überblick

Wenn derzeit das in kommerziellen biochemischen Identifizierungskits oder biochemischen Identifizierungsröhrchen verwendete Kulturmedium dasselbe ist wie das Medium, das in den Bestätigungstests dieses Standards verwendet wird, können diese Kits oder Röhrchen gemäß den Gebrauchsanweisungen verwendet werden, um diese Bestätigung durchzuführen Experiment.

7.4.2. Belastungsvorbereitung

Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Petrischale, streichen Sie die Kultur auf die Nähragarplatte und kultivieren Sie sie bei 37 ºC ± 1 ºC für 48 ± 2 h. Mindestens eine gut isolierte charakteristische Kolonie sollte von jeder Schale genommen, ausgestrichen und auf die Agarschale übertragen und für Bestätigungstests aufbewahrt werden.

7.4.3. Morphologische Beobachtung

Die ausgewählten gereinigten Kolonien wurden mittels Gram-Färbungsmikroskopie (3.3) untersucht. Bacillus subtilis-Zellen sollten stäbchenförmig sein, mit Sporen, die oval geformt sind, mesozoisch oder fast mesozoisch, und die Zysten sollten nicht in signifikantem Maße vergrößert sein.

7.4.4. Physiochemischer Bestätigungstest

Die gereinigten Kolonien wurden für folgende Tests ausgewählt: 7 % Natriumchloridwachstum (3,4), VP-Test (3,5), Nitratreduktion (3,6), D-Mannit-Fermentation (3,7) und Propionatverwertung (3,8).

7.4.5. Bestätigung der Ergebnisse

Die Bestätigung der Ergebnisse ist wie folgt:

1. Bacillus subtilis-Kolonien haben raue Oberflächen, sind undurchsichtig, grauweiß oder gelblich im Aussehen, stäbchenförmig mit ovalen Sporen, Mesozoikum oder nahezu Mesozoikum, mit Zysten, die nicht signifikant vergrößert sind.

2. Die Testergebnisse sind positiv für 7 % Natriumchloridwachstum, VP-Tests und Nitratreduktion.

3. Säure kann durch D-Mannitol-Fermentation hergestellt werden.

4. Es kann als Bacillus subtilis ohne Verwendung von Propionat beurteilt und bestimmt werden.

Die Unterscheidungsmerkmale von Bacillus Subtilis und Bacillus-ähnlichen Bakterien sind unten in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1. Unterscheidungsmerkmale von Bacillus subtilis und Bacillus-ähnlichen Bakterien

8. Ergebnisberechnung und Bericht

8.1.  Berechnung der Anzahl der Bacillus Subtilis-Kolonien auf jeder Schale.

Berechnen Sie die Anzahl der Kolonien von Bacillus Subtilis (a) auf jedem Gericht mit Formel 1:

Formel 1

ein =(b ÷ A) × C

Legende:

a:Anzahl der Bacillus Subtilis-Kolonien auf jeder Schale;

b:Anzahl der Kolonien, die nach der Probenauswahl als Bacillus Subtilis-Kolonien bestätigt wurden;

EIN:Anzahl der zur Bestätigung ausgewählten Kolonien (5);

C:Anzahl der Kolonien auf der Schale, die die Unterscheidungsmerkmale von verkörpert Bacillus subtilis

Das Endergebnis (a) sollten gemäß den numerischen Rundungsregeln in GB/T 8170 auf die nächste ganze Zahl gerundet werden.

Zum Beispiel:

Wenn sich auf der Schale insgesamt 78 Kolonien befinden, die Merkmale von Bacillus Subtilis aufweisen, werden 5 für den Bestätigungstest ausgewählt und 4 davon werden als Bacillus Subtilis-Kolonien bestätigt, dann:

a= (4/5) x 78 = 62,4

a= 62,4 ~ 62

Gemäß den numerischen Rundungsregeln in GB/T 8170 ist die Anzahl der Bacillus Subtilis-Kolonien (a) auf diesem Gericht ist 62.

8.2.  Anzahl der Bacillus subtilis-Kolonien in der Probe: Berechnungsmethode und Bericht

Wählen Sie 2 Reihenverdünnungsschalen (jede Verdünnung sollte mindestens eine Schale mit einer bestätigten Anzahl von Bacillus Subtilis zwischen 30 und 300 auf der Schale haben), berechnen Sie mit Formel 2, was 1 ml oder 1 g Bacillus Subtilis in der Probe entspricht , N.

Formel 2

N = Ʃa / V (n₁ + 0,1 n₂) · d

Legende:

N:Die Gesamtzahl von Bacillus Subtilis in der Probe;

Ʃa:Die Gesamtsumme bestätigter Bacillus Subtilis auf allen Gerichten;

IN:Inokulationsvolumen der Schale, ml;

n₁:Anzahl der Schalen für die erste Verdünnung;

n₂:Anzahl der Gerichte für die zweite Verdünnung;

d:Der Verdünnungsfaktor der ersten Verdünnung (der Wert vondfür unverdünnte Proben ist 1).

Das Endergebnis (N) sollte gemäß den numerischen Rundungsregeln in GB/T 8170 auf die nächsten 2 signifikanten Stellen gerundet werden. Die Anzahl der Bacillus Subtilis-Kolonien in der Probe kann auch in wissenschaftlicher Notation (1,0 – 9,9 mal 10) aufgezeichnet werden^x).

Geben Sie die geschätzte Anzahl von Bacillus subtilis pro ml oder g der Probe an, KBE/g oder KBE/ml.

Beispiel 1:

Wenn nach der ersten Verdünnung (10^-3), beträgt die bestätigte Anzahl von Bacillus subtilis-Kolonien 168 bzw. 215, und nach der zweiten Verdünnung (10^-4), beträgt die bestätigte Anzahl von Bacillus Subtilis-Kolonien 34 bzw. 35, dann:

N = (168 + 215 + 34 + 35) / [0,1 x (2 + 0,1 · 2) x 10^-3]

N = 472 / 0,00022

N = 2145450 ~ 2100000

Gemäß den numerischen Rundungsregeln in GB/T 8170 beträgt die geschätzte Anzahl von Bacillus Subtilis der Probe in diesem Beispiel in Einheiten von g oder ml 2100000 CFU/g (oder ml) oder 2,1 x 10⁶ CFU/g (oder ml).

Beispiel 2:

Wenn die letzte Verdünnung (10^-4) bestätigt, dass die Anzahl der Bacillus Subtilis-Kolonien 120 bzw. 130 beträgt, dann:

N = (120 + 130) / (0,1 x 2 x 10^-4)

N = 250 / 0,00002

N = 12500000 ~ 12000000

Gemäß den numerischen Rundungsregeln in GB/T 8170 beträgt die geschätzte Anzahl von Bacillus Subtilis der Probe in diesem Beispiel in Einheiten von g oder ml 12000000 CFU/g (oder ml) oder 1,2 x 10⁷ CFU/g (oder ml).